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Méthodique
Les fences doivent impérativement avant et après chaque utilisation être nettoyés et stérilisés. Afin de mieux préserver le silicone, il est conseillé de retourner les fences lors de la stérilisation et de son non-utilisation. Un détergent, de l′éthanol ou même un bain ultra-son de courte durée peuvent être utilisés pour le nettoyage.
La stérilisation s′effectue de préférence à 121°C (2 atm, humide). Une stérilisation à 180°C (1 atm, sec) est certes possible, mais une dégradation du silicone peut survenir à la longue. Vous remarquerez qu′après chaque stérilisation le silicone colle, c′est pourquoi, il est conseillé d′attendre une bonne heure avant de manipuler les fences.
Les fences rempliront une plaque de 24 multipuits, qui ira à peu près 30 minutes dans un incubateur préchauffé (à 37°C), afin que la tenue du silicone à la surface de chaque fence soit rendue possible.
Sous le régime d′expansion de la monocouche : Dans la chambre interne de chaque fence de 16 mm seront versées les cellules dans 150 µl de médium (correspondant par exemple à 30.000 HUVEC), et dans la chambre externe sera versé uniquement 650 µl de médium (sans les cellules) pour accroître l′étanchéité de la chambre interne.
Sous le régime "wound closure" (cicatrisation des plaies) se produit le cas inverse au cas précédent, c′est-à-dire que les cellules seront injectées dans la chambre externe dans 650 µl de médium (équivalent à par exemple 130.000 HUVEC) et dans la chambre interne y seront mis uniquement (sans les cellules) 150 µl de médium. Ainsi, on peut s′imaginer le développement d′un essai d′interactions cellulaires avec différentes cellules à l′intérieur et à l′extérieur. Il est important de pénétrer le plus profondément possible dans le fence avec la pipette, afin que toute création de bulle d′air soit évitée.
Après que les cellules aient eu le temps de se fixer dans l′incubateur pendant 4 à 5 heures, les fences seront retirées à l′aide d′une pince et chaque puit sera lavé deux fois prudemment (avec par exemple du Phosphate Buffered Saline), pour éloigner les cellules non-adhérentes. Ensuite sera incorporé avec ou sans les substances recherchées 1 ml médium. Il est recommandé d′effectuer cet essai 3 à 4 fois afin d′optimiser les résultats. Dès lors commence réellement l′essai.
Pour mieux faire la distinction entre migration et prolifération, soit on expose les cellules aux rayons à 15-25 Gy (1500-2500 rad) soit on ajoute à la procédure des essais une toxine (par exemple 10-20 µl/ml 5-Fluorouracil, selon certains articles jusqu′à 100 µl/ml) pour éviter la prolifération.
Le diamètre de la monocouche est au début de l′essai de 6,57 mm (varie selon le comportement cellulaire), ce qui correspond à une surface de 35 mm2. Après une incubation d′environ 5 à 7 jours (avec HUVEC) avec des changements fréquents de médium (par ex. tous les 2 jours) s′est étendue la monocouche. Après ce délai, un mélange d′éthanol-méthanol (1 pour 1) ou 5 à 10% de la solution Paraformaldehyde-in-Buffer (pendant 3 à 10 minutes) sera introduit, ce qui permettra aux cellules de se fixer.
Après un lavage, les cellules seront teintées (par ex. avec 10% de solution Giemsa pendant 20 minutes, suivi d′un lavage à l′éthanol pendant 1 minute maximum). La surface des cellules peut être mesurée visuellement à l′aide par exemple d′une grille millémétrique (par exemple papier millémétrique transparent) ou d′un oculaire quadrillé. Le mieux est un système de vidéo informatique qui mesure le diamètre.
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30.05.2020 11:20]